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ELISA法检测HIV-1/2抗体

2010/01/05 留下评论

ELISA法检测人血清或血浆中的HIV-1/HIV-2抗体

1 范围
本方法诊断试剂盒-ELISA法检测人血清或血浆中的HIV-1/HIV-2抗体。

2 原理
人体感染HIV后,病毒在体内不断繁殖,破坏相应的靶细胞。人体对HIV产生一系列的抗体免疫应答,通过检测血液中特异性的HIV抗体判断是否存在HIV的感染。
ELISA(酶联免疫吸附剂测定,Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。在测定时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。本方法的检测波长为450nm。

3 试剂和材料
ELISA检测抗-HIV试剂盒。试剂盒组成:
(1)HIV-1/HIV-2抗原包被微孔板 12孔/条×8
(2)抗–HIV阴性对照 1瓶(1m1)
(3)抗–HIV阳性对照(已灭活处理) 1瓶(1m1)
(4)酶结合物 1瓶(12m1)
(5)样品稀释液 1瓶(12m1)
(6)浓缩洗涤液(用前1:20稀释) 1瓶(50m1)
(7)底物A液 1瓶(6m1)
(8)底物B液 1瓶(6m1)
(9)终止液 1瓶(6m1)

4仪器
MK-2型酶标仪,96孔洗板机。

5试剂制备
血清或血浆的制备
在无菌条件下用含有10%小牛血清PBS缓冲液将血清或血浆稀释成值弱阳性,分别以每管0.5ml分装,置-20℃保存备用。

6 操作步骤
6.1 每次实验均须设立空白对照2孔,不加样品稀释液;抗-HIV阳性对照2孔,加抗-HIV阳性对照各100ul;抗-HIV阴性对照3孔,加抗-HIV阴性对照各100ul。
6.2 剩余各孔加样品稀释液100ul后加待测标本10ul,振荡反应板、使之充分混匀(本试剂盒样品稀释液为绿色,加入新鲜血浆或血清后变为蓝色,如为稀释样本,变色反应不明显)。
6.3 置37℃孵育30分钟。
6.4 取出已孵育完毕的反应板,将洗涤液注满每孔,吸干,反复5次,在干净纱布(或吸水纸)上将板拍干。
6.5 空白对照2孔不加酶结合物,剩余各孔加酶结合物100ul,充分混匀,置37’C孵育30分钟。
6.6 洗涤同步骤4。
6.7 每孔加底物A液50ul或1滴,底物B液50ul或1滴,振荡反应板,使之充分混匀,置37℃孵育15分钟。
6.8 每孔加终止液50ul或1滴,振荡反应板,使之充分混匀。
6.9 在酶标读数仪中,取波长450nm,以空白对照孔校零,读取每孔吸收值(加终止液后,务必在15分钟内读数完毕)。

7结果分析
7.1 抗-HIV阳性对照OD值应≥0.6,抗-HIV阴性对照OD值应<0.08
7.2 临界值(C.0):阴性对照均值×2.8
阴性对照OD值大于0.08应舍弃,若所有阴性对照孔OD值都大于0.08应重复试验;阴性对照孔OD值低于0.05时以0.05计算。
7.3 结果判定:样品OD值S/C.O≥1者为HIV抗体反应阳性。
样品OD值S/C.O<1者为HIV抗体反应阴性。
7.4 阳性者须取样双孔复试,复试阳性者应按全国HIV管理规范送HIV确认实验室进行确认试验。若是血站标本,确认试验报告阴性者,血可发放使用,凡确认阳性或可疑者,血不能发放使用,统一送确认实验室处理。

注意事项:
(1)本试剂的使用单位必须是经当地卫生行政部门批准的HIV初筛实验室。
(2)整个HIV检测必须符合《全国艾滋病检测工作规范》,严格防止交叉感染。操作时必须戴手套、穿工作衣,严格健全和执行消毒隔离制度。
(3)HIV-1/HIV-2抗体测定结果的判定必须以酶标仪读数为准。
(4)样品稀释液应用加液器加注,并经常校对其准确性。
(5)洗涤时各孔均需加满液体,防止孔口有游离酶不能洗净。
(6)所用样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
(7)微孔板条从冷藏环境中取出时应在室温中平衡至潮气干尽方可使用,未用完者须放入有干燥剂的密封袋中保存。
(8)用于检测的样品应保持新鲜。
(9)剩余样品及废弃物应经121℃高压蒸汽灭菌30分钟,或用5.0g/L次氯酸钠等消毒剂处理30分钟后废弃。
(10)不同批号试剂组分不得混用。

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